THESE 2008

Résumé

Le di-isopropyl éther (DIPE) dont les MON et RON sont respectivement de 112 et 98, est un additif possible des essences. La synthèse chimique de ce composé met en jeu l’alcool isopropylique (IPA) dans la réaction de Williamson. Ce projet de thèse vise à produire l’IPA à partir des hexoses et pentoses de la biomasse, en utilisant des souches de Clostridium génétiquement modifiées.
Clostridium beijerinckii notamment utilise les sucres selon le métabolisme de la fermentation IBE (isopropanol, butanol, éthanol). Des mutants capables de produire sélectivement de l’IPA seront construits par mutagénèse dirigée, à partir de souches sauvages, dont les performances de production seront préalablement évaluées. La construction de la cassette de délétion s’appuiera sur le génome de Clostridium acetobutylicum dont la séquence est entièrement connue. La suppression des gènes de la β-hydroxybutyryl-CoA déshydrogénase et/ou de la crotonase conduisant au butyryl-CoA dans la voie de dégradation, devrait logiquement réorienter le flux métabolique du butanol vers l’IPA. Ce dernier produit étant moins toxique que le butanol pour les microorganismes, il est logique d’espérer atteindre des concentrations plus élevées d’IPA dans les milieux de culture.
La production d’IPA par le(s) mutant(s) a été étudiée en fermenteur, par cultures discontinues sur hexoses (glucose) et sur pentoses (xylose et arabinose).
Les travaux de construction génétique ont été effectués à A&F, Wageningen, Pays-Bas, et ceux de fermentation à l’IFPEN, Rueil-Malmaison.

Résultats

Les préoccupations écologiques et économiques suscitent un regain d’intérêt pour la fermentation productrice d’isopropanol, connue sous le nom de fermentation IBE (isopropanol, butanol et éthanol).
Chez les microorganismes excrétant de l’isopropanol, l’acétone est hydrogénée via une réaction catalysée par une alcool déshydrogénase secondaire (s-Adh) codée par le gène adh. Les études cinétiques de l’enzyme s-Adh purifiée de Clostridium beijerinckii NRLL B593 ont confirmé que le substrat physiologique est bien l’acétone et non l’isopropanol.
L’optimisation de la production d’IBE par C.beijerinckii NRLL  B593 a permis d’obtenir 13,2 g/l d’IBE dont 4,5 g/l d’isopropanol.
La production d’isopropanol a été ensuite étudiée chez C. acetobutylicum ATCC 824 en y clonant le gène de l’alcool déshydrogénase secondaire de la souche C. beijerinckii NRLL B593. Deux souches génétiquement modifiées ont été obtenues et capables de réduire en isopropanol plus de 95% de l’acétone formé. Pour ces deux souches de C.acetobutylicum modifiées, les productions d’IBE étaient de 17 g/l dont 6 g/l d’isopropanol, contre 20 g/l d’ABE (acétone, butanol et éthanol) dont 6 g/l d’acétone pour la souche sauvage.
Pour améliorer la production d’IBE des souches génétiquement modifiées, trois nouveaux plasmides furent construits, contenant les gènes des enzymes actives dans la conversion de l’acétoacétyl-CoA en acétone. Les nouvelles souches ainsi obtenues ont produit environ 24 g/l d’IBE dont un peu plus de 8 g/l d’isopropanol.
Les souches modifiées n’excrètent pas ou très peu d’acétoïne  qu’elles réduisent en 2-3 butanediol, à la différence de la souche sauvage de C. acetobutylicum ATCC 824.

Livrables

• Manuscrit de la thèse

• Page de couverture de la thèse

Publications et communications

• F. Collas et al. (2010). Improvement of isopropanol production from glucose by engineering of a Clostridium strain. Congrès Nederlandse Biotechnologische Verenigin, Delft (Pays-Bas), 11-12 Mars 2010

• F. Collas et al. (2012). Simultaneous production of isopropanol, butanol, ethanol and 2,3-butanediol by Clostridium acetobutylicum ATCC 824 engineered strains. AMB Express, 2, 45, 1-10 

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Rémy Marchal
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